由于primer软件虽然可以调控出较为优质的定量引物

但是由于繁琐的过程，以及最后的基因blast，导致在设计多个基因多条引物的时候需要消耗掉大量时间

因此合理运用NCBI直接生成所需要的引物，是一个非常效率的方法

以成脂标志基因PPARγ为例

首选需要找到这个基因和这个基因所属的物种（我以牛为例）

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搜索后列表中第一个即可

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CTRL+F 搜索Genbank 进入

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此界面是目的基因信息

由于基因定量需要用到RNA反转录成的cDNA

所以设计基因定量引物则需要在mRNA上进行

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可能某些基因有多个转录本mRNA（可变剪接）存在，但是如无必要，选第一个即可

点击transcript_id：后的链接

进入的页面就是mRNA序列页面，这其中包括不编码蛋白的5’UTR和3‘UTR

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搜寻pick primer直接点击进入

基因定量引物的设计理念很简单

一般是退火温度要求在60°左右；80-200bp的序列长度；序列要跨基因外显子；不要有错配（如果要做绝对定量，则要试验出引物最佳退火温度）

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物种已经选好，并且选择mRNA库进行blast

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因此配置如上图所示，生成

结果如图：

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由图可知：

primer6；primer9；primer8 跨外显子

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再看引物互补指数（越低越好）

因此 primer6；primer9 都可以用于基因定量